Flow Cytometry(유세포 분석) (2) - 응용

지난 글에서는 flow cytometry에 대한 개요, 원리, 특징에 대해 알아보았습니다. Flow cytometry를 통해 세포의 크기, 모양, 과립도 등 전반적인 특징을 알 수 있고, 세포에 붙어 있는 형광 신호를 감지해서 세포가 가지는 특성을 알 수 있습니다. 본 글에서는 실제로 flow cytometry가 어떻게 사용되는지 알아보고자 합니다.

Fluorescent Antibody(형광 항체) 사용

유세포 분석에서 가장 많이 사용되고 있는 기술입니다. 특정 단백질(Antigen, Ag, 항원)에 붙은 항체(Antibody, Ab)를 사용함으로써 세포에 발현하고 있는 단백질을 분석하여 해당 세포가 어떤 특징을 가지고 있는지 알 수 있습니다. 이 때 사용하는 항체에는 반드시 형광 물질이 conjugation 되어 있는 것을 사용해야 합니다.

분석하고자 하는 세포에 세포막 단백질인 A 단백질이 발현하고 있는지 확인하기 위해서 anti-A-형광 형태의 항체를 세포에 staining 해야 합니다. 이 후, 유세포 분석을 통해 형광 시그널을 분석함으로써 A 단백질 발현 여부와 발현 정도를 알 수 있습니다.

 

세포내 존재하는 단백질(사이토카인, 핵내 transcription factor 등) 도 분석할 수 있습니다. 이 때는 세포를 fixation(고정), permeabilization(투과)하는 과정이 필요합니다. 그래야 항체가 세포 내로 들어갈 수 있게 되는 것입니다. 또한, 세포 내 단백질을 안정적으로 관찰하기 위해서 protease inhibitor 등을 처리하기도 합니다.

 

Fluorescent Protein(형광 단백질) 사용

형광을 반드시 항체를 사용하여 분석할 필요는 없습니다. 유전자 조작을 통해 살아있는 마우스 또는 세포에 특정 유전 물질을 삽입 또는 삭제 할 때, 형광 유전자도 함께 넣는 등 분석하고자 하는 단백질 발현 유무를 판단할 수 있습니다. 예를 들어, 분석하고자 하는 세포에 C 단백질을 발현시키려 한다면, C 단백질을 발현할 수 있는 C 유전자에 GFP 유전자가 함께 있는 DNA를 세포에 넣습니다. 그리고 나서 유세포 분석을 통해 GFP 발현 여부를 확인하기도 합니다. 만약 GFP발현이 확인된다면 C 단백질이 잘 발현되고 있음을 알 수 있고, GFP 시그널 정도를 통해서 발현양도 확인할 수 있습니다. 이 처럼 세포 자체에서 발현되는 형광 단백질을 검출함으로써 세포가 어떻게 변했는지, cell plasticity(세포 가소성)을 확인할 수 있습니다.

 

Fluorescent Dye(형광 염색 시약) 사용

형광 dye 를 세포에 직접 처리해서 세포의 특성을 확인할 수 있습니다. 주로 세포 내 DNA를 염색하는 형광 염색 dye를 많이 사용합니다. 예를 들어, propidium iodide(PI)을 세포에 처리한 후 유세포 분석기로 분석하면 데이터를 histogram으로 나타낼 수 있습니다.  x축은 PI의 세기, 즉 세포 내 DNA 양을 의미하고, y축은 분석한 세포 수를 의미합니다. PI 값이 크다면 DNA양이 많음을 의미합니다. 이를 통해 세포의 주기(cell cycle), 세포의 apoptosis 등을 확인할 수 이습니다. 이 외에도 CFSE, Annexin-V, DAPI dye염색을 통해 세포 분열 및 cell viability를 분석할 수 있습니다.

 

이 외에도 다양한 활용도가 있습니다. 여러 분야 연구에서 기본적으로 많이 사용되고 있습니다.

 

Flow cytometry - 형광

결국 항체 conjugation 된 형광을 인식하고 구분하는 것이 flow cytometry의 핵심입니다. 우리가 가시광선 번위에서 색을 눈으로 구분하듯이, flow cytometer도 다양한 파장의 형광을 구분합니다. 하지만 flow cytometry의 형광은 가시광선과는 달리, 레이저(빛)을 형광 물질에 가하면 그 형광 물질이 가지는 고유한 파장을 내보냅니다. 즉, 형광 물질이 스스로 만들어 내는 특정 파장의 빛을 인식하고 분석합니다. 그 형광의 종류에는 PE, FITC, APC, PE-Cy7, PerCP-Cy5.5, Alexa Fluor 700, BV 421 등의 color 가 존재하고, 실험 디자인에 맞게 color를 선택합니다.

Multi Parameter Flow Cytometry (이미지 출처: Wiley Analytical Science)

 

Flow Cytometry(유세포 분석) (1) - 원리, 특징

 

형광의 필수 요소: Excitation, Emission

- Excitation: 형광 물질이 빛을 내기 위해 가해져야 하는 에너지 파장 스펙트럼 입니다.

- Emission: 에너지를 받아 형광 물질이 발현하는 빛 입니다.

형광의 이 두 특성으로 인해, 빛을 가했을 때 해당 형광 물질이 자신의 고유한 파장의 빛을 나타내는지 기계가 측정하고, 그 강도를 측정함으로써 형광 항체의 존재 및 양을 분석할 수 있습니다.