Flow Cytometry(유세포 분석) (1) - 원리, 특징

Flow cytometry(유세포 분석) 이란?

 

세포 표면 수용체, 세포 내 단백질, 세포 크기 등 분석하고자 하는 세포의 특징을 알기 위해서 사용하는 기술입니다. 'Flow cytometry' 이름에서도 알 수 있듯이, 기계 내 유액상태의 세포를 흘려주어 에너지(빛)을 사용하여 세포의 특징을 분석하는 실험법입니다. Flow cytometer(유세포 분석기) 장비를 사용하고, fluorescence(형광)를 기반으로 세포를 분석할 수 있습니다.

 

 

Flow cytometery 분석 원리

유세포 분석기를 통해서만 실험이 가능하고, 이 기기는 크게 3가지 system을 순서대로 거쳐 세포를 분석합니다.

- Fluidic system: 분석하려는 세포를 레이저 detection 부분까지 보호하면서 정확하게 이동해주는 시스템입니다. 

- Optical system: 샘플을 감지하는 시스템입니다.

-  lectronic system: 감지한 signal을 전류로 변환하고, 수치화 하는 시스템입니다.

 

Flow cytometry system 모식도 (이미지 출처: Labome)

1. Fluidic system 

세포의 특성을 분석하기 위해서는 기기 내로 분석하고자 하는 샘플을 흘려야 합니다. 유세포 분석은 각각의 세포를 1개씩 분석하기 때문에, 세포 1개씩 흐를 수 있도록 해야합니다. 유세포 분석기의 fluidic system에서는 관 표면에 식염수를 흘려 더 빠른 용액의 흐름을 일으키고, 이 과정에서 세포들이 관의 중심으로 모이게 합니다. 이로써 core stream이 발생합니다. 결과적으로 세포들이 동일한 속도와 동일한 유속 및 흐름(laminar flow)으로 순차적으로 흐를 수 있게 됩니다. 이 기술을 hydrodynamic focusing이라고 합니다.

 

2. Optical system

위 과정을 거친 세포들은 optical system을 통과하게 됩니다. Light(빛)을 사용해서 세포의 특성을 감지하는 구간입니다. 분석하고자 하는 세포들이나 입자들은 그 크기가 매우 작고, 빠른 속도로 이동하기 때문에, 이를 감지하기 위해서는 laser beam(강한 빛)이 필요합니다. 동인한 속도로 흐르는 세포들이 레이저 구간을 통과하게 되는데, 이 때 레이저와 세포가 만나는 지점을 interrogation point라 합니다. Interrogation point를 통과하면 세포의 특성과 성질에 따라 빛이 분산되고, 분산되는 정도에 따라 세포의 크기 및 과립도 등을 알 수 있습니다. 세포가 클 수록 분산되는 범위가 넓고, 반대로 세포가 작으면 분산되는 범위가 좁습니다.

3. Electronic system

이 후에 electronic system에서 분산된 빛, 산란도를 전압 펄스로 변환시킵니다. 세포 크기가 크면 산란도가 크기 때문에 전압도 높아지게 됩니다. 이를 데이터화 하면 histogram과 같은 그래프를 만들 수 있습니다. 이 때, x축은 빛이 산란된 정도, 즉 세포의 크기를 의미하고, y축은 측정한 세포의 수 또는 세포의 과립도를 의미합니다.

 

 

 

Flow Cytometry(유세포 분석) (2) - 응용

 

 

FSC와 SSC 란?

- FSC(Forward scattering): 세포의 크기를 의미합니다. 전방의 detector 에서 분산되는 빛의 양에 따라 감지되므로 forward scattering이라 합니다.

- SSC(Side scattering): 세포의 과립도를 의미합니다. 측면의 detector 에서 분산되는 빛의 양에 따라 감지되기 때문에, side scattering이라 합니다. 이를 통해 세포 내 핵의 모양, 세포질에 존재하는 입자의 양 및 종류 등을 알 수 있고, 세포의 특징에 따라서 분류할 수 있습니다.

따라서 FSC와 SSC를 통해 종합적으로 세포의 크기, 모양, 과립도 등 전반적인 세포의 상태를 알 수 있습니다.

 

Flow cytometry 특징

Flow cytometry는 세포에서 방출되는 형광(빛)을 감지할 수 있습니다. 이 분석을 위해서는 antibody(항체)에 형광이 conjugation된 것을 사용하거나 fluorescence dye를 사용해야 합니다. 세포가 interrogation point를 통과하면 FSC, SSC가 분석되는 동시에 세포에서 방출되는 형광이 레이저를 통해 감지되고, 감지된 형광은 적정 파장의 emission filter를 거쳐 각 파장에 일치하는 detector에 전달됩니다. 이를 통해 세포에 존재하는 형광의 세기를 감지할 수 있고, 여러개 형광을 동시에 감지할 수 있는 특징이 있습니다. 이렇게 얻은 빛의 세기로 electronic system 으로 전달 및 수치화 됩니다. Histogram 및 dot plot의 형태로 데이터화 할 수 있습니다.

 

예를들어 내가 연구하고자 하는 세포가 세포막 단백질 CD14+ 특징을 가진다면, 분석하고자 하는 세포 샘플에 anti-CD14-형광 형태의 항체를 staining 하고, flow cytometry 분석을 하면 내가 원하는 CD14+ 세포만 분석하거나 분리할 수 있습니다.

Western blot분석은 특정 세포 수 에서 발현하는 목적 단백질의 전체 양을 알 수 있는 것이어서, 단백질 발현의 유, 무 정도를 알 수 있지만, 유세포 분석은 한개의 세포 수준에서 목적 단백질이 얼마나 발현하고 있는지 정확히 분석할 수 있기 때문에 더 정밀한 기술입니다.